Analisis Kualitatif Rhodamin B Dalam Sampel Sirup Dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Analisis Kualitatif Rhodamin B Dalam Sampel Sirup

Dengan Kromatografi Lapis Tipis

A. Tujuan
Menganalisis Rhodamin B dalam sampel dengan membandingkan nilai Rf senyawa yang dianalisis dengan nilai Rf Rhodamin B.

B. Dasar Teori

1. Pelarut atau Pengembang
Polaritas beberapa pelarut atau pengembang yang umum digunakan disusun sebagai berikut:





Zat pelarut bergerak atau mengembang melalui adsorban. Percobaan ini untuk memisahkan campuran menjadi komponen-komponennya. Kebanyakan campuran polar, digenggam pada adsorbant. Pet. eter tidak dapat mengeluarkan senyawa lebih polar dibandingkan pet. Eter itu sendiri, kebanyakan dari komponen campuran ditinggalkan. (tidak ada pemisahan)

Kemudian mencoba metanol, salah satu zat pelarut yang paling polar. Metanol sungguh menggenggam ke adsorbant. Metanol membongkar apa saja atau hampir semua molekul pada campuran. Betapapun, metil alkohol lebih polar, namun ini dapat bergerak terus saja dan memindahkan molekul yang lain. Dan ini benar. Sehingga, ketika metanol diuapkan semua komponen dari campuran telah digerakkan dengan metanol, sehingga satu titik yang tergeser, sejalan dengan bahan pelarut. (tidak ada pemisahan)

Mencoba satu lagi yang lebih baik, mencoba kloroform, karena ini yang punya satu muatan polar perantara. Kloroform bergerak diikuti campuran, dan mampu untuk mendorong keluar atau nyaris mengeluarkan salah satu komponen. Bergerak meninggalkan noda, hal ini memperoleh jerih dan awal untuk meninggalkan beberapa komponen polar di belakang. Sesaat kemudian, hanyalah komponen tertentu bergerak dengan kloroform, dan yang mungkin ditinggalkan juga. Sehingga, pada bagian akhir, ada beberapa noda dan masing-masing sebesar ukurannya ketika berada di dalam satu tempat berbeda dari awal. Masing-masing noda adalah paling tidak satu komponen berbeda dari campuran seluruhnya. (Pada akhirnya ada pemisahan)

Ada resiko dari penggunaan kloroform, karena dapat menyebabkan kanker. Banyak zat pelarut umum lain, juga, diduga karsinogen. Di laboratorium, perlu diketahui zat pelarut (eluent) yang sesuai untuk dipergunakan atau harus menemukan sendiri, kebanyakan oleh percobaan dan kesalahan (trial and error).

1. Prinsip KLT
Catatan kromatografi lapis tipis pada awalnya diberikan oleh Beyerinck pada 1889 dan Wijsmann pada 1896. Metode KLT ini dikembangkan oleh seorang ahli yang bernama Egon Stahl, yaitu dengan cara meletakan penyerap pada sebuah lempeng gelas. Keuntungan dari metode ini antara lain 1) diperlukan sampel dalam jumlah relatif sedikit, 2) peralatan yang digunakan relatif murah dan sederhana, 3) waktu analisis relatif singkat, 4) memiliki daya pisah yang relatif bagus. Derajat retensi pada metode KLT ini dinyatakan oleh besarnya nilai Rf (retensi factor) yang merupakan perbandingan antara jarak tempuh zat terlarut terhadap jarak tempuh pelarutnya.

Prinsip pemisahan dengan KLT adalah pemisahan campuran (biasanya dalam jumlah mikrogram) oleh gerakan pelarut pada permukaan datar (pelat). Komponen larutan bermigrasi pada tingkat yang berbeda-beda karena perbedaan kelarutan, adsorpsi, ukuran atau muatan. Elusi dihentikan pada saat bagian depan pelarut mencapai garis batas sisi atas pelat KLT dan dianalisa lebih lanjut pola pemisahannya.

Lapisan tipis dapat terbuat dari komponen selulosa bubuk, silika gel, alumina, pertukaran ion atau gel yang telah diuji secara densitometri dan spektrometri. KLT digunakan dengan sangat luas, sebagian besar untuk tujuan kualitatif baik bahan organik maupun anorganik, terutama berguna untuk pengujian tingkat kemurnian, untuk memantau reaksi dan proses produksi serta untuk mengkarakterisasi senyawa kompleks.

Kelemahan KLT adalah migrasinya yang sangat peka terhadap kondisi karakteristik tertentu, lapisan tipis mudah rusak, dan presisi kuantitatif hanya moderat: 5-10%. Perbedaan antara teknik ini dengan GC atau HPLC adalah bahwa proses pemisahan terjadi pada permukaan dasarnya yang datar dalam dua dimensi. Komponen yang terpisah biasanya tidak dielusi dari permukaan tetapi langsung diperiksa di situ, kemudian dapat dihilangkan secara mekanis untuk analisa lebih lanjut. Dalam kromatografi lapis tipis (KLT), fase stasioner biasanya berupa padatan silika gel atau alumina yang dilapisi selembar kaca, atau plastik alumunium. Meskipun kelembaban dapat dipertahankan oleh fase diam, namun proses pemisahan secara dominan hanya pada salah satu permukaan adsorpsi. Lapisan tipis kadang-kadang dibuat dari pertukaran ion atau bahan gel permeation. Dalam kasus ini proses penyerapan dengan pertukaran ion. Sampel yang digunakan sebagai titik-titik atau garis-garis yang dekat dengan salah satu ujung pelat dan fase gerak diperbolehkan untuk berjalan dari tepi salah satu dan menuju tepi berlawanan. Dengan demikian, komponen bergerak di seluruh permukaan sampel pada tingkat yang diatur dengan rasio distribusinya dan karena itu terpisah menjadi tempat individu atau band. Prosedur ini disebut pengembangan. Setelah pengembangan, zat berwarna segera terlihat di permukaan. Yang tidak berwarna dapat divisualisasikan dengan penyemprotan menggunakan reagen chromogenic, atau dideteksi dengan fluoresensi di bawah lampu UV atau dengan menggunakan pelacak radioaktif. Difusi dan massa menyebabkan efek perpindahan dimensi tempat terpisah untuk meningkatkan pada semua arah sebagai hasil elusi. Difusi molekul dan transfer massa, semua berkontribusi untuk menyebarkan sepanjang arah aliran. Akibatnya, tempat awalnya berupa lingkaran elips menjadi terpisah sesuai arah aliran. Elusi harus dihentikan sebelum pelarut depan mencapai tepi atas dari pelat KLT sebagai jarak gerak yang harus diukur dalam rangka untuk menghitung faktor retensi (nilai Rf) dari komponen yang telah terpisah.

Ada beberapa faktor yang mempengaruhi nilai Rf dan resolusi. Nilai Rf zat terlarut ditentukan oleh rasio distribusi yang pada gilirannya tergantung pada kelarutan relatif untuk sistem partisi atau polaritas relatif untuk sistem adsorpsi. Misalnya, jika adsorpsi KLT digunakan untuk memisahkan campuran squalene (hidrokarbon), metil oleat, kolesterol dan tokoferol-(vitamin E), kemudian squalene yang sedikit polar akan bergerak jauh dan kolesterol yang paling polar, akan tetap dekat ke titik asal. Metil oleat kurang polar dibandingkan tokoferol dan karenanya akan ditemukan antara kedua squalene tersebut.

Meskipun pemisahan hasil lebih cepat pada temperatur tinggi, tetapi resolusinya rendah karena peningkatan tingkat difusi. Namun, dalam adsorpsi KLT hanya terjadi peningkatan kecil terhadap nilai Rf yang diamati bahkan dengan kenaikan 20° C. Kontrol suhu yang ketat tidak diperlukan jika sampel dan standar dijalankan pada saat yang sama, walaupun fluktuasi yang besar harus dihindari. Kualitas bahan lapis tipis, dan khususnya adanya kotoran di dalamnya, menentukan sejauh mana partisi, adsorpsi, pertukaran ion dan partisi eksklusi dalam proses penyerapan. Faktor-faktor ini mempengaruhi nilai-nilai Rf dalam cara yang sering kali tak terduga. Lapisan harus memiliki ketebalan yang seragam antara 0,2 dan 0,3 mm dengan lapisan tipis, variasi lokal dalam ketebalan dapat menghasilkan variasi yang cukup baik dalam nilai-nilai Rf. Suasana yang stabil dengan uap jenuh dari fase gerak diperlukan untuk memastikan nilai-nilai Rf direproduksi dengan baik. Kecuali pada kondisi saturasi, pelarut akan menguap dari permukaan lapisan tipis menyebabkan aliran pelarut meningkat tetapi gerakan lambat pada depan pelarut; nilai Rf akibatnya meningkat. Dalam prakteknya, kromatogram yang terbaik dikembangkan dalam tangki kaca tertutup di mana suasana jenuh telah diproduksi yang disiapkan sekitar 15 menit sebelum kromatogram dikembangkan. Jumlah optimum sampel yang diperlukan untuk memproduksi spot terdeteksi dengan penyebaran minimal karena overloading adalah sekitar 0,01 mg sampai 50 mg. Sampel yang jauh lebih besar dari ini, isoterm menjadi nonlinier, nilai-nilai Rf berubah secara signifikan dengan ukuran sampel dan resolusi rendah karena tailing atau fronting meningkat.

Prosedur pengembangan metode ascending digunakan terutama, meskipun tidak ada alasan mengapa pengembangan menurun atau horizontal tidak dapat digunakan untuk tujuan khusus. Sebuah metode alternatif terdiri dari membentuk sandwich dengan pelat kaca dengan ukuran yang sama dengan pelat kromatografi. Keduanya dijepit bersama-sama dengan spacer tipis untuk melindungi permukaan lapisan tipis dan sisi bawah direndam dalam palung yang sempit berisi pelarut. Volume kecil udara yang terjebak antara dua pelat dengan cepat jenuh dengan pelarut pengembang. Deteksi komponen yang dipisahkan segera dapat dilakukan bila zat berwarna dapat diamati secara visual di situ setelah pengembangan kromatogram, tetapi yang tidak berwarna harus divisualisasikan dengan cara fisika atau kimia. Bagi banyak sampel, dan terutama yang muncul sebagai bintik-bintik neon ketika diiradiasi pada 370 atau 254 nm. Sebuah metode alternatif adalah untuk menggabungkan indikator neon ke dalam lapisan tipis ketika non-fluorescing bahan menunjukkan sebagai bintik gelap di latar belakang neon. Catatan yang lebih permanen dapat dilakukan dengan memotret kromatogram.

Setiap bahan fase diam yang digunakan dalam kolom, penukar ion dan kromatografi eksklusi dapat digunakan untuk KLT asalkan bahan itu dapat diperoleh dalam bentuk bubuk yang homogen ukurannya berupa partikel halus (1-50 pm). Bahan kasar tidak akan mudah membentuk lapisan tipis seragam yang melekat pada sebuah pelat kaca atau lembaran pendukung lainnya. Pra-lapis tipis dilapisi pelat yang tersedia secara komersial tetapi relatif mahal. Pelat dengan berbagai fase stasioner dapat disiapkan di laboratorium menggunakan alat mekanik penyebar. Ini terdiri dari palung untuk mengadakan bubur fase diam dan datar untuk mendukung sejumlah pelat. Dengan menggerakan palung pada pelat, bahkan lapisan lumpur diendapkan dari pelarut yang dapat diuapkan dengan oven pengeringan. Silika gel atau asam silikat, telah menjadi penggunaan yang paling luas pada KLT. Ini fase stasioner untuk sistem partisi. Pelat dilapisi dengan silika gel sering mengandung sekitar 10% b/b kalsium sulfat (plester dari Paris) sebagai pengikat untuk meningkatkan kepatuhan terhadap pelat, meskipun hal ini tidak penting jika bahan bubuk yang sangat halus digunakan. Indikator yang berpendar di bawah lampu UV dapat dimasukkan ke dalam lapisan ketika disiapkan, misalnya garam natrium dari fluorescein. Alumina kadang-kadang digunakan sebagai alternatif untuk silika gel tetapi tidak memberikan keuntungan tertentu. Untuk senyawa yang relatif polar. Selulosa bubuk digunakan untuk partisi KLT yang bertindak terutama sebagai dukungan solid seperti pada kromatografi kertas. Tempat yang lebih kompak daripada yang diperoleh dengan kromatografi kertas dan waktu pengembangan yang lebih cepat karena ukuran partikel halus. Sejumlah serbuk selulosa penukar ion tersedia untuk pemisahan spesies ion. Reagen yang selektif menghambat spesies kimia tertentu dapat dimasukkan ke dalam pelat lapis tipis.

Silika gel merupakan bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan silika gel, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada permukaan silika gel terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.




Permukaan silika gel sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Prinsip pada silika gel kemudian digunakan serupa untuk alumina.

Fase gerak ditarik melalui lapisan tipis oleh aksi kapiler, tetapi tingkat gerakan relatif cepat karena ukuran partikel seragam dan kecil. Pemisahan KLT di pelat 20 × 20 cm hanya membutuhkan waktu 20-40 menit dibandingkan dengan dua jam atau lebih untuk kromatogram kertas berukuran sebanding. Pemilihan fase gerak sebagian besar empiris tetapi aturan umum dapat dirumuskan. Campuran pelarut organik dan air dengan penambahan asam, basa atau zat pengompleks untuk mengoptimalkan kelarutan komponen campuran dapat digunakan. Misalnya, pemisahan yang baik dari zat terlarut polar atau ion dapat dicapai dengan campuran air dan n-butanol. Penambahan asam asetat pada campuran memungkinkan lebih banyak air yang akan dimasukkan dan meningkatkan kelarutan bahan dasar, sementara penambahan amonia meningkatkan kelarutan bahan asam. Jika fase stasioner adalah hidrofobik, berbagai campuran benzena, sikloheksana dan kloroform memberikan fase gerak memuaskan. Harus ditekankan bahwa trial and error terlibat dalam pemilihannya. Untuk KLT pada silika gel, fase gerak dengan polaritas serendah mungkin harus digunakan konsisten dengan mencapai pemisahan yang memuaskan. Pelarut polarnya sendiri dapat menjadi kuat teradsorpsi sehingga menghasilkan sebuah sistem partisi, sebuah situasi yang mungkin tidak diinginkan. Sebuah seri eluotropic dapat digunakan untuk membantu pemilihan pelarut atau campuran pelarut yang terbaik untuk suatu sampel tertentu.

KLT dapat digunakan untuk tujuan analisis kualitatif. Komponen yang diidentifikasi dengan perbandingan nilai-nilai Rf-nya dengan standar berjalan di bawah kondisi yang sama, atau dengan menghapus bahan dari kromatogram dan menundukkannya untuk uji kualitatif lebih lanjut, misalnya uji-tempat, spektrometri massa, spektrometri inframerah. Faktor yang mempengaruhi nilai Rf perlu dipertimbangkan. Bahan kromatografi dan kondisi yang biasanya begitu variabel yang disarankan untuk menjalankan standar dengan sampel untuk memastikan bahwa perbandingan yang valid.

Kromatografi lapis tipis tidak memberikan informasi kuantitatif dengan presisi dan akurasi yang tinggi. Hubungan linier antara massa zat dan logaritma atau akar kuadrat dari daerah tempat kadang-kadang bisa didirikan di bawah kondisi yang terkendali dengan sangat erat. Absorbansi optik dari titik pengukuran ditentukan oleh reflektansi dapat juga berhubungan dengan massa, atau zat bisa dikorek dari pelat dan dilarutkan dalam pelarut yang cocok untuk penentuan spektrometri. Kesulitan utama dengan daerah dan pengukuran kepadatan terletak dalam mendefinisikan batas-batas tempat dan reaksi chromogenic. Presisi relatif dapat sebagus 1-2% tetapi lebih biasanya 5-10%.

1. Rhodamin B
Rhodamin B adalah zat warna sintetis berbentuk serbuk kristal, berwarna hijau atau ungu kemerahan, tidak berbau dan dalam larutan akan berwarna merah terang berpendar. Zat berfungsi sebagai pewarna sintetis pada industri tekstil atau kertas, namun banyak disalahgunakan sebagai zat pewarna pada beberapa jenis pangan karena warnanya mencolok dan harganya yang relatif murah. Padahal pewarna ini termasuk bahan kimia berbahaya (harmful), berbahaya bila tertelan, terhisap pernapasan atau terserap melalui kulit. Toksisitasnya adalah ORL - RAT LDLO 500 mg Kg-1. Rumus kimia Rhodamin B adalah C28H31N2O31Cl, dengan massa relatifnya 479,02 gram per mol. Rumus struktur Rhodamin B dapat dilihat pada Gambar 1.




Gambar 1. Struktur Rhodamin B

Adapun sifat-sifat Rhodamin B adalah sebagai berikut:


a. Sifat fisika
1) Serbuk kristal, berwarna hijau atau ungu kemerahan, tidak berbau dan dalam larutan akan berwarna merah terang berpendar
2) Titik lebur 155^oC
3) Absorbansi maksimal tercapai pada panjang gelombang 550 – 552 nm

b. Sifat kimia
1) Larut dalam alkohol serta sedikit larut dalam asam dan alkali, tidak larut dalam air
2) Merupakan zat warna basa yang baik untuk pewarnaan pada serat kapas, kertas, wol, dan sutra
3) Bersifat toksik

Rhodamin B dapat larut dalam alkohol terutama etanol. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 2. Rhodamin B memiliki koefisien ekstingsi molar sebesar 106,000 M-1cm-1 pada panjang gelombang 542.75 nm (anonim, "Eastman Laboratory Chemicals Catalog No.", 1993). Rhodamin B bersifat berflouresensi dalam sinar matahari. Flourescene Emission Spectrum dari Rhodamin B yang dilarutkan dalam etanol pada panjang gelombang 510 nm.

Pemakaian Rhodamin B pada makanan sangat berbahaya. Percobaan pada binatang menunjukkan Rhodamin B di serap lebih banyak pada saluran pencernaan. Kerusakan pada hati tikus terjadi akibat pakan yang mengandung Rhodamin B dengan konsentrasi yang tinggi.

C. Metode
Alat-alat :
Chamber
Lampu UV
Pipet Ukur
Propipet
Erlenmeyer
Kertas Saring Whatman
Corong Funnel
Mortar dan Pestle

Bahan-bahan:
Etanol
Metanol
Amonia
Sampel SB sirup
Pelat KLT

D. Cara Kerja







F. Pembahasan
Kromatogram
Maserasi sampel dilakukan menggunakan metanol, hal ini bertujuan untuk melarutkan semua komponen yang paling polar sampai yang kurang polar. Metanol juga merupakan pelarut yang cukup murah. Jika digunakan n-heksan untuk maserasi maka komponen yang lebih polar dari n-heksan tidak akan larut dan tetap tinggal dalam sampel.

Percobaan ini dilakukan untuk membahas tentang KLT yaitu mencoba melihat bagaimana pemisahan komponen tertentu pada pelat KLT yang merupakan sebuah pemisahan beberapa senyawa dari campuran. Hal ini sangat berguna untuk menganalisis komponen campuran dan uji kemurnian. Sebuah garis digambar menggunakan pensil dekat bagian bawah pelat KLT dengan jarak 1 cm dan sebuah garis pada sisi atas dengan jarak 0,5 cm, kemudian setetes larutan sampel kunyit dari fraksi metanol yang merupakan campuran berwarna kuning ditempatkan pada garis itu menggunakan pipa kapiler. Pelat KLT segera ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup yang berisi pelarut terjenuhkan dengan uap pelarut dan pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak, ketika noda dari tetesan itu telah mengering. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi noda berada, bila sampai sampel tenggelam dalam pelarut maka sampel akan larut sebelum mengembang. Penanda garis bawah yang diberikan pada pelat untuk menunjukkan posisi awal noda sampel. Sampel yang larut dalam fase gerak akan bergerak dalam pelarut dan pengembangan segera dihentikan setelah bagian depan fase gerak mencapai garis batas di sisi atas pelat.

Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Suasana yang stabil dengan uap jenuh dari fase gerak diperlukan untuk memastikan nilai-nilai Rf direproduksi dengan baik. Kecuali kondisi saturasi, pelarut akan menguap dari permukaan lapisan tipis menyebabkan aliran pelarut meningkat tetapi gerakan lambat pada bagian depan pelarut; nilai Rf akibatnya meningkat. Dalam praktikum ini, kromatogram yang dikembangkan dalam tangki kaca tertutup di mana suasana jenuh telah diproduksi, yang disiapkan sekitar 2-3 menit sebelum kromatogram dikembangkan. Oleh karena itu untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia ditempatkan beberapa kertas saring yang ujungnya terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada pelat, komponen-komponen yang berada pada campuran berwarna bergerak dengan kecepatan yang berbeda dan tampak sebagai noda warna pada kromatogram.

Pelarut bergerak sampai pada bagian atas dari pelat. Ini akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam. Fase geraknya adalah pelarut metanol:n-heksan sedangkan fase diamnya adalah pelat KLT silika gel.

Perhitungan nilai Rf
Perhitungan nilai Rf diperlukan untuk mengetahui bagaimana jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran yaitu jumlah komponen yang telah terpisah, sehingga setiap noda yang terbentuk perlu dihitung Rfnya. Pengukuran nilai Rf dapat diperoleh langsung dari pelat untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh masing-masing noda warna.

Pelat dipindahkan dari gelas kimia dan posisi depan pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan, namun karena sudah ditandai maka pelarut tidak boleh melebihi garis batas yang telah ditandai.

Pengukuran berlangsung sebagai berikut:



Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:



Kromatogram yang dihasilkan menunjukkan noda 3,9 cm; 0,8 cm; dan 1,4 cm, untuk masing-masing pelarut metanol:n-heksan 1:99, 1:1, dan 99:1, komponen berwarna kuning dari garis awal, sementara pelarut berjarak 5,0 cm, sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna kuning adalah :



Jika percobaan ini diulang pada kondisi yang sama maka harus memberi hasil yang sama, nilai Rf yang akan diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama. Namun, jika terdapat perubahan (suhu, komposisi pelarut dan sebagainya), nilai tersebut akan berubah. Namun harus tetap mengingat teknik ini jika ingin mengidentifikasi warna tertentu. Kromatogram digunakan untuk menganalisis kemurnian senyawa atau untuk mengidentifikasi senyawanya menggunakan standar yang telah diketahui Rfnya.

Berdasarkan Rf yang dihitung, pemisahan yang paling baik ditunjukkan oleh pelarut metanol : n-heksan = 1:99. Fraksi yang tidak larut dalam n-heksan tampak tidak berubah posisi pada titik awal. Namun fraksi yang larut dalam n-heksan bergerak cukup jauh dengan Rf 3,9/5. Pelarut ini dapat digunakan untuk memisahkan komponen dari campuran. Fraksi yang larut dalam n-heksan dapat dipisahkan dalam corong pisah dengan menambahkan pelarut n-heksan pada fraksi metanol, namun jika kedua pelarut bercampur, maka perlu menggunakan pelarut lain. Komponen yang lebih polar dari n-heksan tidak larut sehingga tidak ikut bergerak dalam pelarut atau fase gerak.

Pemisahan yang ditunjukkan oleh pelarut metanol : n-heksan = 1:1 dan 99:1 tidak baik, bahkan tidak menunjukkan pemisahan sama sekali. Hampir semua komponen yang terlarut dalam metanol bergerak naik dan membentuk noda yang melebar dan berekor.

Fase diam pada sebuah pelat lapis tipis umumnya memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Hal ini berarti jika sampel disinari dengan sinar UV maka akan berpendar. Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana noda pada kromatogram berada, meskipun noda-noda itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa jika anda menyinarkan sinar UV pada pelat, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi noda-noda. Noda tampak sebagai bidang kecil yang gelap.

Sementara UV disinari pada pelat KLT, posisi-posisi dari noda-noda ditandai dengan menggunakan pinsil atau melingkari daerah noda-noda itu. Noda-noda yang di tandai ini akan digunakan untuk menganalisis senyawa-senyawa yang dipisah dari campuran. Hal ini sangat berguna untuk tujuan uji kemurnian senyawa yang akan diisolasi. Dalam setetes campuran fraksi metanol yang ditempatkan pada garis dasar pelat lapis tipis mengandung campuran-campuran senyawa polar dan non polar yang larut dalam metanol.

Ketika pelarut mulai membasahi pelat, pelarut pertama melarutkan senyawa-senyawa dalam noda yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa cenderung bergerak pada pelat kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut.

Kecepatan senyawa-senyawa yang dibawa bergerak ke atas pada pelat, menunjukkan:
Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
Bagaimana senyawa melekat pada fase diam. Hal ini tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan silika gel atau alumina (fase diamnya).

Anggaplah noda awal mengandung dua senyawa atau lebih, yang satu dapat membentuk ikatan hidrogen, dan yang lainnya hanya dapat mengambil　bagian interaksi van der Waals yang lemah. Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat dibanding senyawa lainnya. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan. Penjerapan bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan silika gel dan yang kembali pada larutan dalam pelarut. Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada pelat selama waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada -untuk sementara waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas pelat.

Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan menjerap lebih kuat daripada yang tergantung hanya pada interaksi van der Waals, dan karenanya bergerak lebih jauh pada pelat. Komponen-komponen dalam campuran dapat membentuk ikatan-ikatan hidrogen sehingga terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan . Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari permukaan silika. Senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik pada kromatogram ketika menggunakan perbandingan 1:1 dan 99:1. Perubahan pelarut dapat membantu dengan baik-termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut. Pada tingkatan uji coba ini, jika satu pelarut atau campuran pelarut tidak berkerja dengan baik, maka perlu mencoba (trial and error) pelarut lainnya sampai diperoleh pemisahan yang sempurna.

Hasil pembanding dari percobaan lainnya yaitu menggunakan pelarut metanol:metana = 1:99 menunjukkan ada tiga noda yang terpisah. Hal ini menunjukkan bahwa ada tiga komponen yang terlarut dalam metana, ada tiga komponen yang dapat dipisahkan. Pelarut yang digunakan untuk pemisahan fraksional sebaiknya menggunakan pelarut yang dimulai dari paling polar ke yang kurang polar, berdasarkan hasil KLT dipilih pelarut atau perbandingan pelarut yang sesuai.

Pertanyaan:
1. Apakah kelebihan metode KLT ini dibandingkan dengan metode lainnya?
1) diperlukan sampel dalam jumlah relatif sedikit, 2) peralatan yang digunakan relatif murah dan sederhana, 3) waktu analisis relatif singkat, 4) memiliki daya pisah yang relatif bagus.

2. Apa makna dari nilai Rf itu?
Nilai Rf (retensi factor) merupakan perbandingan antara jarak tempuh zat terlarut terhadap jarak tempuh pelarutnya. Nilai Rf ini dapat digunakan untuk tujuan identifikasi dengan menggunakan standar.

3. Apa fungsi penjenuhan dalam praktikum yang anda lakukan?
Penjenuhan pelarut dan uap pelarut bertujuan untuk menghasilkan nilai-nilai Rf yang baik. Terutama pelarut yang mudah menguap seperti metana, jika dalam kondisi tidak jenuh maka pelarut dapat menguap dari pelat KLT sehingga jarak tempuh pelarut yang diukur kurang tepat sehingga Rf yang dihasilkan juga kurang tepat. Pelarut yang menguap dari permukaan lapisan tipis menyebabkan aliran pelarut meningkat tetapi gerakan lambat pada bagian depan pelarut dan nilai Rf akibatnya meningkat.

G. Kesimpulan
1. Tidak terdapat rhodamin B dalam sampel yang dianalisis.
2. Nilai Rf untuk pelarut metanol:n-heksan:



Saran
Metode KLT dapat digunakan untuk mencoba-coba memilih pelarut yang sesuai untuk memisahkan senyawa dari campuran, untuk menguji kemurnian senyawa yang diisolasi dan merupakan teknik kromatografi yang cukup murah dan sederhana.

Daftar Pustaka

Braithwaite, A., Smith, F.J. (1995). Chromatographic methods (5^th ed.). London: Kluwer Academic Publisher.

Fifield, F. W. (2000). Principles and Practice of Analytical Chemistry (5^th ed.). Japan: Blackwell Science Ltd.

Zubrick, J. W. (1988). The organic chem lab survival manual. New York: John Wiley & Sons.

Petunujuk praktikum kimia lanjut.