Penentuan Kadar Protein Secara Biuret

Tujuan

Menentukan kadar protein dalam sampel telur dan kara secara biuret.

Kajian Pustaka

1.      Struktur Protein

      Sekuens asam amino dalam rantai polipeptida merupakan struktur primer. Protein diketahui sebagai pembawa faktor genetik (DNA) dan berperan bagi fungsi biologis (protein fungsional). Protein tersusun dari kombinasi asam-asam amino. Ada 22 macam asam amino yang dapat dikombinasikan. Asam-asam amino ini terhubung oleh ikatan peptida (gambar 1.), suatu amida tersusun oleh gugus amino dan gugus karboksil.

      Pembentukan ikatan peptida melepaskan suatu gugus amino dan gugus karboksil, dan molekul yang tersisa merupakan komponen utama struktur protein. Rantai polipeptida yang terbentuk dapat berakhir dengan gugus amino (residu ujung-N) dan gugus karboksil (residu ujung-C). Dengan perjanjian penomoran sekuens selalu dimulai dari residu ujung-N.

Gambar 1. Ikatan polipeptida

Bentuk tiga-dimensi rantai polipeptida merupakan struktur sekunder. Bentuk sederhana polipeptida berupa rantai panjang (gambar 2a.). Namun, bentuk stabil dari strukturnya diperkirakan dalam bentuk heliks (gambar 2b.). Bentuk heliks lebih stabil karena adanya ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen bukan ikatan kovalen, ikatan hidrogen terjadi antara atom yang  bermuatan agak positif dan atom yang bermuatan agak negatif.

Gambar 2. Struktur protein sekunder. (a) kerangka struktur protein (b) struktur stabil dengan ikatan hidrogen antara hidrogen dari gugus amino peptida yang satu dengan oksigen dari gugus karboksil peptida yang lain, membentuk heliks.

Kebanyakan protein tidak hanya menunjukkan struktur primer atau sekunder tetapi juga membentuk intermediet. Kehadiran asam imino prolin dan hidroksiprolin menginduksi bend dalam rantai menghasilkan ikatan peptida (gambar 3.). Glisin yang tidak memiliki rantai samping (H) mengijinkan fleksibilitas yang lebih besar pada ikatan peptida. Ikatan antar rantai juga terjadi antara rantai panjang yang paralel menghasilkan struktur seperti lembaran berlipat-lipat dengan ikatan hidrogen antara atom oksigen dan hidrogen dari dua rantai yang berbeda atau dapat juga ikatan anti paralelnya (gambar 4.).

Gambar 3. Efek asam imino pada struktur protein

Rantai anti paralel                         Rantai paralel

Gambar 4. Pleated sheet (lembaran berlipat-lipat) serat protein

2..      Penentuan Protein Dengan Metode Biuret

            Nama metode Biuret sebenarnya nama yang kurang tepat dan kurang sesuai. Metode ini dikembangkan berdasarkan hasil pengamatan bahwa biuret bereaksi dengan suatu larutan alkalin tembaga sulfat menghasilkan kompleks berwarna ungu (keunguan). Protein dan beberapa amina berekasi dengan cara yang sama dengan biuret, sehingga diberi nama metode biuret, walaupun penentuan kadar proteinnya masih samar-samar. Metode ini sangat berguna, walau pun dalam elusidasinya membentuk kompleks tembaga (gambar 7.). Ion tembaga membentuk kompleks ikatan koordinasi dengan empat gugus nukleofil NH, yang dalam reaksi dengan protein disediakan oleh peptida yang mengikat asam amino. 

Gambar 7. Reaksi Biuret

      

1.      Hukum Lambert-Beer

Asumsikan bahwa larutan yang mengandung senyawa yang akan dianalisis volume V_x dengan konsentrasi c_x, dipindahkan ke dalam labu takar volume V_t. Larutan standar volume V_s mL dengan konsentrasi c_s dimasukkan ke dalam masing-masing labu. Reagen pembentuk kompleks berwarna ditambahkan dan diencerkan. Berdasarkan hukum Lambert-Beer absorbansi larutan dideskripsikan sebagai berikut:

= kV_sc_s + kV_xc_x

Dimana k adalah konstanta εb/V_t. A_s sebagai fungsi V_s diplotkan dan menghasilkan garis lurus dengan persamaan:

A_s = mV_s + b

Dimana m merupakan kemiringan garis dan b merupakan intersept dengan persamaan:

m = kc_s dan b = kV_xc_x

Metode

Bahan-bahan:

Albumin (putih telur)

Kara

Reagen Biuret

Larutan standar protein

Akuades

Alat-alat:

Pipet ukur

Gelas beker

Tabung reaksi

Vortex-mixer

Spektrofotometer UV-VIS

Stopwatch

Prosedur:

Pengukuran absorbansi sampel pada lambda (λ) maksimum = 540 nm

Sampel	A1	A2	A
Albumin	0,142	0,140	0,141
Kara	2,961

Perhitungan

Persamaan kurva standar yaitu: y = 0,0537x - 0,0034

dimana y= absorbansi (A) dan x= konsentrasi (C mg/ml)

maka persamaannya dapat ditulis dengan: A= 0,0537C - 0,0034

Penentuan kadar protein dalam putih telur

A= 0,141

A= 0,0537C - 0,0034

             0,141 = 0,0537C - 0,0034

        0,0537C  = 0,141 + 0,0034

        0,0537C  = 0,1444

                   C  = 2,6890 mg/ml

1 ml sampel putih telur yang telah diencerkan 50 kali mengandung protein sebanyak 2,6890 mg/ml. Jika larutannya dianggap homogen maka berlaku M₁V₁=M₂V₂

M₁ x 1 ml = 2,2890 mg/ml x 50 ml

Sampel putih telur mengandung 2,6890 mg/ml x  = 134,45 mg/ml protein.

Penentuan kadar protein dalam kara

A= 2,961 (digunakan karena selisihnya terlalu besar dari data yang ke dua).

A= 0,0537C - 0,0034

             2,961 = 0,0537C - 0,0034

        0,0537C  = 2,961 + 0,0034

        0,0537C  = 2,9644

                   C  = 55,2029 mg/ml

Sampel kara mengandung 55,2029 mg/ml protein.

Pembahasan

            Pemilihan panjang gelombang maksimum perlu dilakukan karena penentuan kadar protein dalam larutan berdasarkan hasil pengukuran absorbansinya. Panjang gelombang berkaitan dengan absorpsi spesifik oleh sampel sehingga perubahan absorbansi per satuan konsentrasi dapat diamati lebih akurat pada panjang gelombang maksimum. Absorbansi yang akan diukur sebaiknya pada panjang gelombang maksimum. Panjang gelombang maksimum yang diperoleh pada percobaan ini adalah 540 nm. Dengan demikian, absorbansi paling baik diukur pada panjang gelombang 540 nm. Kurva standar yang dihasilkan harus linier, bila belum linier sebaiknya larutan sampel perlu diencerkan lagi, dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum ini.

            Kurva standar yang diperoleh dari hasil pengukuran memiliki R=0,9952, artinya kurva standar ini hampir linier sehingga tidak perlu melakukan pengenceran lebih lanjut. Persamaan kurva standar sudah layak digunakan untuk menentukan kadar protein dalam larutan sampel. Persamaan kurva standar yang diperoleh y = 0,0537x - 0,0034, dimana y menyatakan absorbansi (A) dan x menyatakan konsentrasi (C) dalam mg/ml. Kurva dan persamaan ini diperoleh dengan bantuan program microsoft office excel. Dalam percobaan ini, pengukuran absorbansi dilakukan secara duplo, sehingga absorbansi yang digunakan adalah nilai rata-rata dari pengukuran 1 dan pengukuran 2. Nilai-nilai absorbansi hasil pengukuran dibuat dalam bentuk grafik, sehingga berdasarkan grafik dapat dilihat λ maksimum berkisar pada 540 nm.

            Berdasarkan perhitungan sampel putih telur mengandung protein sebanyak 2,6890 mg/ml x  = 134,45 mg/ml, artinya dalam 1 ml putih telur mengandung 134,45 mg protein. Sampel kara mengandung protein 55,2029 mg/ml x  = 55,2029 mg/ml, artinya dalam 1 ml sampel kara mengandung 55,2029 mg protein.

Pertanyaan

1.      Mengapa berlaku Hukum Lambert-Beer pada percobaan ini?

Hukum Lambert-Beer berlaku dalam percobaan ini karena penentuan kadar protein berdasarkan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi. Berdasarkan hukum Lambert-Beer absorbansi larutan dideskripsikan sebagai berikut:

A_s =  +

= kV_sc_s + kV_xc_x

Dimana k adalah konstanta εb/V_t. A_s sebagai fungsi V_s diplotkan dan menghasilkan garis lurus dengan persamaan:

A_s = mV_s + b

Dimana m merupakan kemiringan garis dan b merupakan intersept dengan persamaan:

m = kc_s dan b = kV_xc_x

Hubungan antara absorbansi dan konsentrasi untuk menentukan kadar protein terlihat dari persamaan kurva standar, yaitu: y = 0,0537x - 0,0034 dimana y merupakan absorbansi (A) dan x merupakan konsentrasi (c).

2.      Senyawa apa yang dapat mengganggu cara analisis Biuret ini?

Seyawa polialkohol dapat mengganggu analisis ini, khususnya gliserol dan etilenaglikol, yang bereaksi dengan cara yang sama dengan biuret menghasilkan kompleks sejenis. Selain itu, asam nukleat juga dapat bereaksi dengan cara yang sama dengan biuret. Oleh karena itu, dalam analisis mungkin saja yang terdeteksi bukan kompleks dari protein (asam-asam amino).

3.      Senyawa kompleks apa yang sebenarnya terjadi pada reaksi ini?

Warna ungu yang terjadi karena protein bereaksi dengan biuret membentuk senyawa kompleks. Lebih tepatnya reaksi antara biuret dengan dua atau lebih peptida.

Kesimpulan

1.      Kadar protein dalam sampel putih telur adalah 134,45 mg/ml.

2.      Kadar protein dalam sampel kara adalah 55,2029 mg/ml.

Daftar Pustaka

Holme, D.J, Peck, H. (1998). Analytical Biochemistry (3^rd ed.). England: Pearson Education Limited.

Skoog, A.D, et.al. (2004). Fundamental of analytical chemistry (8^th ed.). USA: Brooks/Cole.

Petunjuk praktikum. Penentuan kadar protein secara biuret.